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• La complessità dell'organismo umano è difficile da simulare o riprodurre. Per questo al momento pochissimi metodi alternativi sono riusciti a sostituire la sperimentazione animale.

Certo, la complessità dell'organismo umano è difficile da simulare o riprodurre. Per questo si commette un grave errore se si pensa che un essere umano sia un ratto un po' più grande. Non bisogna neanche cadere nell'errore di dire che una cellula umana rappresenti l'intero organismo. Si può uscire da questo loop solo impostando la ricerca in maniera seria, concentrandosi su i reali processi biochimici che avvengono sull'uomo. Uno studio di questo tipo può solo essere fatto combinando in modo integrato esperimenti basati su materiale di origine umano con processi computazionali avanzati e analisi epidemiologiche.

• La ricerca di metodi alternativi all'uso di animali procede su due filoni principali: la ricostruzione di organi in laboratorio a partire da cellule isolate (“in vitro”) e l'uso dei computer (“in silico”). Al momento, però, non sono abbastanza attendibili da permettere di abbandonare sempre e del tutto il passaggio in un organismo vivente.

Non ci sono due filoni principali, ma tanti approcci diversi. I metodi in vitro partono da cellule isolate, tessuti umani ricostituiti, organoidi, materiale ex vivo. Ci sono anche studi “in chimico” che valutano la reattività delle sostanze in maniera più assoluta. I metodi “in silico” si sono espansi notevolmente, aggiungendo tutte le potenzialità offerte dall'intelligenza artificiale ai già noti programmi di simulazione basati sulla struttura molecolare delle sostanze esterne, sia che siano inquinanti che provocano un effetto tossico o farmaci che devono curare una patologia. Infatti, non si parla più di “metodi alternativi”, ma di Nuovi Approcci Metodologici” (NAM).

• Nel campo degli studi di tossicità sono stati fatti grandi passi avanti per ridurre il numero di animali utilizzati nella sperimentazione.
• In futuro i ricercatori sperano di poter disporre di strumenti informatici con cui ampliare la possibilità di ricorrere a metodi alternativi.

I ricercatori non “sperano” e il futuro diventa presente se si lavora in una certa direzione.

• Chi si oppone all'uso degli animali nella ricerca medica e scientifica sostiene che esistono metodi alternativi in grado di dare risultati altrettanto validi. Ma è davvero così? In realtà, nella maggioranza dei casi, i metodi studiati per sostituire gli animali nella sperimentazione scientifica andrebbero considerati complementari più che alternativi.

I NAM rappresentano proprio un cambio di paradigma all'approccio tradizionale con animali. Infatti, il principio è quello di concentrarsi sul meccanismo d'azione nell'essere umano a partire dai primi processi biochimici che avvengono quando una sostanza entra nel nostro organismo o avviene una qualunque variazione che può provocare l'insorgenza di una patologia o di una reazione avversa. Il termine corretto è quello di studiare i cammini che portano a un effetto avverso (Adverse Outcome Pathways, AOPs). Molto diverso dal concetto di vedere in un animale gli effetti che sono sempre il risultato finale di un certo processo.

Il problema dei test sugli animali è che si considerano affidabili senza se e senza ma, a volte rallentando la ricerca. Un esempio? Nello studio dell'Alzehimer si sono fatti più progressi in 5 anni di utilizzo dei mini-cervelli (piccole sferette che simulano il cervello umano) rispetto ai 40 anni in cui si è cercato inutilmente di ricreare questa patologia tipicamente umana nei ratti con la conseguenza che ad oggi non abbiamo neanche un metodo valido per una diagnosi precoce.

• Una ricerca condotta con un organismo intero, come è un animale, fornisce risultati che possono essere almeno in parte estrapolati agli esseri umani, date le somiglianze nel patrimonio genetico e nel funzionamento di cellule, tessuti e organi.

(Esatto! Il funzionamento del nostro organismo è molto simile a quello di tutti i mammiferi e anche di tutti gli organismi viventi. In passato, la ricerca con gli animali è stata molto utile per comprendere tante cose. Ma ora siamo arrivati a un momento di stasi ed è giunto il momento di cambiare se si vuole davvero trovare qualcosa di innovativo per risolvere i tanti problemi che tuttora ci sono. Mi riferisco a certe forme tumorali, all'aumento dei casi di autismo tra i bambini, ai problemi di fertilità che tante coppie hanno, eccetera, eccetera. I metodi che vengono applicati per costruire i NAM non erano disponibili venti o dieci anni fa. Oggi ci sono e bisogna sfruttarli se si vuole fare una ricerca moderna).

• Per questo l'uso degli animali è obbligatorio per legge nella sperimentazione di nuovi farmaci.

(Anche in ambito regolatorio le cose stanno cambiando.Negli Stati Uniti la Food and Drug Administration, FDA, ha già eliminato l'obbligo di testare i nuovi farmaci sugli animali).

• I metodi che non utilizzano animali non sono in grado di offrire un'alternativa valida. Per poter sostituire gli animali, bisogna infatti che i nuovi metodi siano attendibili quanto quelli in uso e, al momento, non si hanno tali garanzie nella ricerca biomedica. Ciononostante, vi sono alcuni filoni di studio importanti che già oggi consentono di limitare il numero di animali usati nella ricerca e altri che, in futuro, potranno sostituire gli animali almeno in alcune delle tappe del processo di sperimentazione. Gli esperti restano però scettici sulla possibilità di fare a meno della sperimentazione animale, perché è difficile ricreare in laboratorio la complessità di un organismo intero con tutte le sue interazioni.

Quali esperti? A livello internazionale, purtroppo un po' meno in Italia, è sempre più diffusa la critica al modello animale. E' difficile ricreare in laboratorio la complessità di un organismo intero con tutte le sue interazioni, ma è pericoloso credere che quello che misuro in un animale sia rappresentativo di quello che accade in un essere umano.

Esistono metodi già approvati?

• Contrariamente a quanto pensano molti oppositori della ricerca animale, sono i ricercatori stessi e persino le industrie a spingere per fare ricerca in questo settore. A nessuno infatti fa piacere fare ricerca con gli animali, sia per ragioni etiche sia per i costi piuttosto elevati. (Il vero motivo per cui l'industria sta investendo sui NAM è per risolvere i molti limiti dei test sugli animali. Il 92% dei farmaci che vengono approvati per la sperimentazione clinica sugli esseri umani, non vengono approvati o perché poco efficaci o per via di effetti collaterali gravi che non sono stati evidenziati con gli animali. La domanda è anche al contrario: chissà quanti farmaci potenzialmente molto validi sono stati eliminati perché non adatti alla sperimentazione sugli animali.) Al momento però sono pochissimi i sistemi sostitutivi approvati, alcuni dei quali sono elencati sul sito del Centro referenza nazionale metodi alternativi, benessere e cura degli animali, presso l'Istituto zooprofilattico sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER). Si tratta, nella quasi totalità dei casi, di sistemi per valutare l'irritazione cutanea e oculare provocata dalle sostanze, utili soprattutto nel campo della cosmetica più che della ricerca medica.

Il sito IZSLER fa riferimento ai metodi alternativi validati con procedura tradizionale, cioè utilizzando i risultati dei test sugli animali come riferimento. Questo va bene per misurare effetti locali, ma non funziona per effetti sistemici che sono rappresentati dai NAM, per cui si sta studiando un modo diverso per approvare l'uso di queste metodiche in ambito regolatorio. OECD ha creato un gruppo di lavoro per l'accettazione delle AOP, i pathway che sono alla base delle strategie di testing con metodi in vitro. Questa attività può essere monitorata sul sito AOP wiki, in cui al momento ci sono quasi 500 pathways, di cui 35 già approvati.

• Non è un caso che riguardino l'aspetto più semplice della tossicologia, ovvero i possibili effetti sulla pelle o sugli occhi, che dipendono in gran parte dalla struttura chimico-fisica dei prodotti, fattori noti ai ricercatori anche prima di cominciare i test. Non appena gli esperti si trovano a studiare gli effetti di una sostanza in situazioni più complesse, devono tornare a usare gli animali.

I programmi dei congressi internazionali smentiscono questa affermazione. Al congresso della società europea di tossicologia dell'anno scorso (Eurotox 2023) si possono vedere 9 contributi caratterizzati dalla parola chiave “in vivo” e 93 con la parola chiave “in vitro”: esattamente un rapporto di uno a dieci! Solo 10 anni fa questo rapporto era invertito, indicando chiaramente quale è la direzione che hanno preso i ricercatori internazionali al passo con i tempi.

• Sempre nel campo della tossicità (uno degli ambiti in cui gli animali sono più utilizzati), l'Unione Europea ha stabilito, con una normativa chiamata REACH, l'istituzione di una banca dati in cui le industrie sono tenute a depositare i protocolli e i risultati di tutte le sperimentazioni effettuate con gli animali per una determinata sostanza. Si è infatti scoperto che alcune sostanze sono state testate più e più volte solo perché un'industria non era a conoscenza del fatto che un'altra aveva già condotto la stessa sperimentazione.

(A questo proposito, vorrei rimandare alle nostre pubblicazionidel 2016 in cui dimostriamo la scarsa riproducibilità dei test in vivo ripetuti più e più volte! “ Global analysis of publicly available safety data for 9,801 substances registered under REACH from 2008-2014. ALTEX 33(2), 95-109”, “Analysis of public oral toxicity data from REACH registrations 2008-2014.ALTEX 33(2), 111-122” “Analysis of Draize eye irritation testing and its prediction by mining publicly available 2008-2014 REACH data. ALTEX 33(2), 123-134” “Analysis of publically available skin sensitization data from REACH registrations 2008-2014. ALTEX 33(2), 135-148”).

• Grazie alla banca dati, ora chiunque può sapere se l'analisi di tossicità di un composto è già stata effettuata e con quale esito. È possibile anche sapere se qualcuno ha condotto studi specifici, per esempio nel campo della cancerogenicità, e mettere insieme le informazioni provenienti da fonti diverse, evitando di ripetere esperimenti già fatti e di coinvolgere così altri animali.

In effetti è qualcosa di più, perché è proibito ripetere un test in vivo se è già disponibile. Chi l'ha eseguito è costretto per legge a condividere i risultati.

• Con le nuove normative europee in materia di sperimentazione animale sono stati stanziati anche fondi specifici per la ricerca di metodi alternativi. Nonostante gli investimenti italiani abbiano già superato il mezzo miliardo di euro, i risultati non hanno rispettato le attese. A oggi non più del 20 per cento delle sperimentazioni con animali è sostituibile con metodi alternativi che offrano uguale attendibilità, secondo lo European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL-ECVAM), il centro europeo di riferimento per lo sviluppo e la validazione dei metodi alternativi alla sperimentazione animale che ha sede in Italia (a Ispra).

Questo è interessante: se il 20% è sostituibile, perché non si fa? E' una ammissione che il 20% dei test sugli animali è evitabile? Questo sarebbe perseguibile per legge!

• Cosa vuol dire che il metodo alternativo deve essere affidabile?Significa che i suoi risultati devono essere validi almeno quanto quelli del sistema di riferimento, che a oggi rimane la sperimentazione negli animali. Secondo i dati raccolti recentemente dal database internazionale REACH, l'attendibilità della sperimentazione animale si aggira intorno all'85-90 per cento. Ciò significa che, su 10 esperimenti eseguiti con animali, 9 daranno risultati attendibili.

Mi piacerebbe sapere da dove viene questo dato. Il fatto che i test sugli animali siano accettati per legge, non significa che siano anche affidabili. Esistono dati certi sull'uomo solo per irritazione occhi e pelle e per la sensibilizzazione cutanea. Infatti questi sono gli endpoint per cui esistono strategie di test in vitro che si è dimostrato essere più rilevanti per l'uomo rispetto ai test in vivo. Per endpoint più complessi come la tossicità a dose ripetute, tossicità per la riproduzione e lo sviluppo, cancerogenicità non si può affermare niente! Anzi, a dire il vero, ci sono molte indicazioni che i test sugli animali sono fuorvianti, basti pensare che il 92% dei farmaci che superano la fase pre-clinica di test in vivo, poi falliscono miseramente quando somministrati sull'uomo. Un altro dato certo è che la correlazione dei test di cancerogenicità tra ratti e topi è del 60% (se fosse il 50%, sarebbe come decidere lanciando in aria una monetina). Come possiamo pensare che la correlazione tra ratto-uomo o topo-uomo sia migliore?

• Può sembrare poco, ma in realtà è un livello di attendibilità molto alto in biologia e medicina, dove si deve tener conto del fatto che gli organismi viventi non sono mai perfettamente uguali tra loro e dove il 100 per cento non è mai raggiungibile. I metodi cosiddetti alternativi forniscono risultati meno attendibili perché nessuno è riuscito a creare modelli artificiali di un organismo che siano al tempo stesso complessi, variabili e flessibili, come sono gli esseri viventi.

In realtà, se si legge la linea guida OECD 497 per la sensibilizzazione cutanea dice esattamente il contrario: la strategia in vitro fornisce risultati migliori riguardo alla risposta sull'uomo. In effetti è vero che un test in vitro non costituisce un modello complesso come un essere vivente e quindi è necessario costruire strategie di test integrate che combinano i risultati da diversi esperimenti. E' complicato e chiaramente c'è un certo margine di errore, che è valutato con attenzione. E' pericolosissimo testare sugli animali e prendere i risultati così come sono come validi anche per l'uomo. L'errore che si commette è di gran lunga maggiore.

• E infatti, benché la messa a punto di diversi sistemi sperimentali sia stata pubblicata su riviste scientifiche, sono pochissimi quelli che hanno passato l'esame di validazione, cioè che sono stati effettivamente autorizzati nella pratica.

Si è già detto che la procedura di validazione così come è stata concepita trent'anni fa non è applicabile ai NAMs. I vari enti regolatori, ECVAM per la UE, ICCVAM negli stati uniti e OECD a livello internazionale, stanno lavorando tutti insieme per costruire un processo per l'accettazione dei nuovi metodi basati sui meccanismi della biologia umana che i nuovi metodi sono in grado di riprodurre oltre a un sistema per trasportare in modo quantitativo i risultati.

• Quali sono i principali filoni di studio?
• Gli organoidi
• Un'area di ricerca promettente prevede la creazione di organi in coltura, detti organoidi. Si tratta di insiemi di cellule e tessuti che, pur non avendo la complessità del corrispondente organo completo, possono essere più utili a capire gli effetti di una sostanza sull'organismo rispetto a cellule di un solo tipo cresciute in singolo strato in piastre di coltura. Per fare un esempio pratico, se uno scienziato vuole capire gli effetti di un farmaco sul cervello, non può limitarsi a studiare la sostanza in un singolo strato di neuroni isolati in coltura, perché nel cervello ci sono anche altre cellule e altri tessuti, oltre a quello nervoso in senso stretto. Inoltre, i diversi tipi di cellule dialogano tra loro, quindi il farmaco potrebbe interferire con numerosi processi. Uno studio condotto soltanto con cellule in coltura non permetterebbe mai di mettere in luce questi aspetti.
• Sono così state sviluppate tecniche per produrre minuscole sfere di tessuto che idealmente dovrebbero contenere tutti gli elementi cellulari noti del cervello. Questi cosiddetti “mini cervelli” sono grossi quanto una capocchia di spillo, simili a sfere cave. Sono già utilizzati in sperimentazione e sono utili soprattutto perché permettono di valutare una sostanza su un gran numero di campioni, evitando di dover ricorrere a molti esemplari di animali di laboratorio. I “mini cervelli”, tuttavia, non sono uno strumento adeguato per ricerche in cui è necessario studiare un cervello in un organismo intero. Per esempio, un organoide di tessuto cerebrale non potrebbe aiutare a comprendere se il farmaco riesce, per esempio, a superare la barriera ematoencefalica che separa e protegge il cervello stesso dal resto del corpo.

Attenzione che esiste una differenza tra culture 3D, tipiche dei minicervelli, e gli organoidi che sono riproduzioni più complesse dell'organo umano. Riguardo all'esempio riportato nel testo, bisogna dire che esistono altri modelli che simulano la barriera ematoencefalica, proprio per capire data una certa esposizione, quanta sostanza possa arrivare alle cellule del cervello. Chiaramente bisogna considerare tutto: assorbimento, metabolismo, distribuzione nell'organismo ed escrezione. E' una fase importante nelle strategie di testing in vitro. Tra parenetsi, ricordo che esiste una differenza enorme tra la barriera ematoencefalica dei roditori e quella dell'uomo.

• Partendo da cellule prelevate da tumori sono stati creati organoidi di tumore del colon, del pancreas, del seno e della prostata. Generare per lo stesso paziente organoidi di tessuto sano e di tumore può aiutare sia a comprendere i meccanismi responsabili della trasformazione neoplastica sia a scegliere la terapia più adatta. Sperimentando una batteria di farmaci sugli organoidi del paziente si possono, per esempio, selezionare quelli che uccidono le cellule del tumore senza danneggiare quelle normali. Gli organoidi potrebbero quindi dare un forte impulso alla medicina di precisione in campo oncologico.

Qui c'è un po' di confusione: esistono cellule prelevate da tumori che vanno a costituire linee cellulari, cellule o tessuti prelevati direttamente dalle persone e che derivano per esempio da plasma o da biopsie e infine cellule umane adulte che sono state riprogrammate per diventare cellule staminali, in grado poi di generare tutti i tessuti dell'organismo umano. Queste sono le più usate per i sistemi 3D e gli organoidi.

• I modelli “in silico”
• Un altro filone di studio riguarda i cosiddetti modelli “in silico”, cioè simulazioni computerizzate di processi cellulari e fisiologici che possono offrire informazioni preliminari sulle attività di una sostanza. Per ora questi sistemi sono utilissimi a classificare le sostanze in probabilmente innocue o probabilmente tossiche in base alle loro caratteristiche chimiche e fisiche. Questo permette di ridurre il numero di animali impiegati nello studio di un nuovo farmaco, ma certo non basta a eliminarli del tutto.
• I metodi che utilizzano i computer offrono qualche vantaggio rispetto a quelli che impiegano gli animali. Per esempio, i computer sono in grado di “imparare” da precedenti risultati e utilizzare le conoscenze generate dagli studi scientifici per migliorare le proprie capacità predittive su nuove sostanze. Un altro vantaggio è la velocità: i computer sono in grado di analizzare le caratteristiche di tantissime sostanze in poco tempo.

Ricordo che i dati a disposizioni oggi sono tantissimi (si è già citato più volte ad esempio il database ECHA). Insieme alla potenza raggiunta dai computer e all'approccio dell'intelligenza artificiale, sono disponibili oggi mezzi che erano impensabili anche solo fino 10 o addirittura 5 anni fa!

• I ricercatori stanno valutando anche una nuova strategia: invece di costruire algoritmi che classificano le sostanze in base a qualità chimico-fisiche, cercano di elaborare strumenti informatici che mimano i possibili meccanismi d'azione. È un passo avanti nella ricostruzione virtuale della complessità dei viventi, ma è ancora ben lontano dai risultati necessari.

Non è proprio una nuova strategia: si fa da tantissimi anni. Come si diceva prima, quello che è cambiato oggi sono le nuove tecnologie a disposizione.

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